خلاصه پایان نامه جدا سازی و همسانه سازی ژن های hrpW و hrpG جهت انتقال به لیمو ترش در راستای ایجاد مقاومت به شانکر مرکبات
چکیده
بیماری شانکر بهوسیلهی باکتری (Xanthomonas citri pv. citri) ایجاد می‌شود که هر ساله عملکرد و کیفیت محصولات خانواده مرکبات، بهویژه لیموترش و پرتقال را تحت تاثیر خود کاهش می‌دهد. این پژوهش با هدف جداسازی و همسانهسازی دو ژن رمز کنندهی هارپینهای HrpW و HrpG از باکتری Xcc سویه NIGEB-088 و ساخت پلاسمیدهای نوترکیب pBI-hrpG و pBI-hrpW بهمنظور توسعهی استراتژی مقاومت به بیماری شانکر بر مبنای القای واکنش دفاعی در گیاه لیموترش انجام شد. بدین منظور آغازگرهای اختصاصی (رفت و برگشت) برای تکثیر این ژنها با استفاده از توالی کامل DNA ژنومی باکتری عامل این بیماری، طراحی شد. ژن‌های تکثیر شده سپس به منظور همسانهسازی، در پلاسمیدهای pGEM7zf(-) و همچنین pUC19 به ترتیب برای ژن‌های hrpW و hrpG، با جایگاههای برشی XbaI و SacI و همچنین XbaI وBamHI وارد شد و پلاسمیدهای نوترکیب در باکتری E.coli سویه DH5α تراریخت شدند. به منظور بیان ژنها در گیاه، قطعهی مورد نظر در ناقل pBI121 و در جایگاههای برشی برای ژن‌های هدف همسانهسازی شد، بهطوری که ژن‌های مورد نظر تحت کنترل پیشبر ویروس موزائیک گل کلم 35S و پایانبر NOS در ناحیهی DNA T- این ناقل قرار گرفت. با استفاده از واکنش زنجیرهای پلیمراز، هضم آنزیمی و توالییابی حضور ژن‌های هدف در کلونیهای مثبت مورد تایید قرار گرفت. این ناقلهای پلاسمیدی نوترکیب را می‌توان در انتقال ژن به گیاهان حساس به این بیماری مانند لیمو ترش و پرتقال با استفاده از آگروباکتریوم مورد استفاده قرار داد. در نهایت پلاسمیدهای نوترکیب به سویههای مورد نظر آگروباکتریوم تومفاسینس منتقل و حضور ژن‌های مربوطه مورد تایید واقع شد. سویههای آگروباکتریوم تومفاسینس تایید شده در برنامههای انتقال ژن مورد استفاده قرار خواهند گرفت.
کلمات کلیدی: شانکر مرکبات، همسانهسازی ژن، باکتری زانتوموناس سیتری، ژن های هارپین
1-مقدمه
1-1-مقدمهای بر مرکبات
مرکبات با نام علمی Citrus spp. از خانواده‌ی Rutaceae و زیرخانواده‌ی Auranutideae هستند. مرکبات گیاهانی بوته‌ای، درختچه‌ای با شاخ و برگ متراکم می‌باشند، اغلب گونه‌های مرکبات (مانند پرتقال[1]، گریپ‌فروت[2] و دورگ‌های نارنگی[3]) در نواحی نیمه گرمسیری با زمستان سرد فقط یک بار در سال در اواخر زمستان و اوایل بهار گل می‌دهند. اما در نواحی گرمسیر و ساحلی ممکن است درختان مرکبات مانند لیموها[4] و لایم‌ها که در بهار و تابستان گل می‌دهند، در طول سال چندین مرتبه گل داده و یا اینکه دوره‌ی گلدهی بسیار طولانی داشته باشند (دیویس و همکاران، 1994). در مرکبات گل‌ها 8-4 گلبرگ ضخیم سفید، قرمز یا ارغوانی رنگ، 5-4 کاسبرگ و 32-16 پرچم دارند. تخمدن دارای 14-6 برچه‌ی بیضوی متصل به خامه‌ی خیلی باریک و گاهی متورم و پهن بوده که به کلاله‌ی کروی ختم می‌شود. گل‌ها در مرکبات دو جنسی هستند و همچنین نوع گرده‌افشانی مرکبات برحسب گونه متفاوت است و خودگشن، خودگشن- دگرگشن و پارتنوکارپ هستند. بهعنوان مثال، لیموترش عموماً خودگشن می‌باشد (کاستل و جمیتر، 1999).
میوه‌ی مرکبات غنی از ویتامین‌های A، B، C، فیبر، کربوهیدرات (قندهای ساده، فروکتوز، گلوکز و ساکارز) و مقادیری کلسیم، پتاسیم، نیاسین و اسیدفولیک می‌باشد که موجب پایین آوردن کلسترول خون، پیشگیری از عفونت‌های ویروسی و احتمال بروز سرطان روده و معده می‌شود (گورنستئین و همکاران، 2001). تولید مرکبات در جهان امروز از اهمیت بسزایی برخوردار است و یکی از منابع مهم ثروت، مبادلات تجاری و اشتغال به کار ساکنین حدود 137 کشور مرکبات‌خیز جهان به‌شمار می‌آید. حدود یکصد صنعت در جهان، از مرکبات در تولید فرآورده‌های خود استفاده می‌کنند. از موارد مهم و قابل توجه در صنعت مرکبات بالا بودن ارزش افزوده‌ی این محصول از طریق تولید محصولات جانبی آن است، که شامل مواد اولیه‌ی دارویی، غذایی و آرایشی و بهداشتی می‌شود (اسماعیل و ژانگ، 2004).
کشت و کار مرکبات بین عرض‌های جغرافیایی 40 درجه‌ی شمالی و جنوبی از خط استوا صورت می‌گیرد که در سطوح تجاری مناطق عمده‌ی تولید مرکبات جهان در بین عرض‌های جغرافیایی 5/23-40 درجه‌ی شمالی و جنوبی قرار دارند. حداقل حرارت مورد نیاز برای شروع رشد مرکبات (صفر فیزیولوژیک) 5/12 درجه‌ی سانتیگراد و متوسط دمای مناسب جهت رشد مطلوب 5/18 درجه سانتیگراد است، مرکبات ماهیانه به 180 ساعت مجموعه‌ی حرارتی نیاز دارند (فتوحی و همکاران، 1385). دما و آب به صورت چشمگیری در تنظیم زمان و دوره‌ی گلدهی، توزیع گل، درصد تشکیل میوه و وضعیت نمو و ریزش میوه‌ی درختان مرکبات تأثیر دارند. مرکبات جهت رشد و نمو در مناطق مرطوب به میزان 750 و در مناطق خشک به 1500 میلی‌متر (15 هزار متر مکعب آب در هکتار) آب در سال نیاز دارند (خوشخوی و همکاران، 1373). سرما و یخبندان از جمله مسائل محیطی خطرساز برای مرکبات در کنار بیماری‌ها[5] و آفات[6] به شمار می‌روند.
بهترین نوع خاک برای کشت و کار مرکبات، خاک شنی- لومی می‌باشد، و همچنین در محدوده‌ی 5/5 تا 5/7 از pH عملکرد خوبی دارند. در بین محصولات باغی، مرکبات حساس‌ترین گروه به شوری خاک می‌باشند (خوشخوی و همکاران، 1364).
1-2-تاریخچه‌ی کشت درختان مرکبات در ایران و جهان
منشأ مرکبات را می‌توان جنوب شرق آسیا، چین و مجمع الجزایر هند و از 2400 سال قبل از میلاد مسیح دانست (جمیتر و هو، 1990). از کناره‌های جنوبی دریای مازندران نیز به عنوان دومین کانون گسترش کشت مرکبات نام برده می‌شود (الهی‌نیا ،1383). ورود مرکبات به ایران به جز گونه‌ی بالنگ، سابقه‌ای 400 ساله دارد. به استناد مدارک تاریخی، ایران دروازه‌ی خروج مرکبات از آسیا به سایر مناطق جهان بوده است (الهی‌نیا، 1383).
1-3-سطح زیر کشت، میزان تولید و عملکرد درختان مرکبات در ایران و جهان
بر اساس گزارش آمار مرکبات وزارت کشاورزی در سال 1392، سطح زیر کشت مرکبات کشور در قالب سه ناحیهی مرکزی، شمالی و جنوبی به میزان 288108 هکتار و میزان تولید 4299247 تن بوده است که این آمار نشانگر تمایل جمعیت برای مصرف و در نتیجه لزوم اهمیت بیشتر به تحقیقات و کشت این محصول در راه تامین نیازهای غذایی جمعیت رو به افزایش کشور است.
تولید مرکبات کشور حدود 4 میلیون تن برآورد شده و 3/86 درصد آن از اراضی آبی حاصل شده است. راندمان[7] تولید مرکبات آبی در کشور 6/16931 کیلوگرم در هکتار است. بیشترین و کمترین عملکرد آبی به ترتیب با 2/21832 و 7/438 کیلوگرم به استان‌های مازندران و لرستان تعلق دارد.
بر اساس آمار فائو در سال 2008، سطح زیر کشت مرکبات در دنیا 7/8 میلیون هکتار بوده و میزان متوسط تولید محصول مرکبات جهان 122 میلیون تن گزارش شده است. بررسی کشورهای عمده‌ی تولیدکننده‌ی مرکبات نشان می‌دهد که از نظر سطح زیر کشت به ترتیب چین، برزیل، نیجریه، مکزیک، آمریکا، هند، اسپانیا و ایران مقام اول تا هشتم را به خود اختصاص داده‌اند. این در حالی است که براساس میزان تولید مرکبات، کشورهای برزیل، آمریکا، چین، مکزیک، اسپانیا، هند، ایتالیا و ایران به‌ترتیب در رده‌های اول تا هشتم قرار گرفته‌اند (آمار نامه کشاورزی، 1388). از لحاظ عملکرد[8] مرکبات نیز به ترتیب آمریکا، ترکیه، آفریقای جنوبی، ژاپن و آرژانتین مقام‌های اول تا پنجم را دارا هستند درحالیکه ایران از این حیث در جایگاه دهم قرار می‌گیرد.
علی‌رغم وجود پتانسیل‌های لازم جهت کشت و کار مرکبات در کشور، اما وجود عوامل محدودکننده و همچنین عدم مدیریت صحیح باعث شده کشور ایران تنها 4/0 درصد از سهم تجارت جهانی[9] مرکبات را داشته باشد (آمارنامه محصولات باغی، 1387)، که این موضوع نشان‌دهنده‌ی نیاز به انجام مطالعات بیشتر پیرامون این عوامل محدودکننده‌ی زیستی[10] و غیر زیستی[11] و مدیریت این عوامل با بهره‌گیری از دانش و تکنولوژی‌های نوین در راستای کاهش اثرگذاری آنها بر کشت و کار، تولید و صادرات این محصول می‌باشد.
1-4-اهمیت و انواع بیماری‌های مرکبات
اهمیت بیماری‌های گیاهی برای انسان به علت خساراتی[12] است که در نتیجه‌ی بیماری به گیاهان و فرآورده‌های آنها وارد می‌شود. بیماری‌های گیاهی ممکن است عامل محدودکننده‌ی کاشت یک گیاه در یک منطقه و یا یک کشور بوده و تمام گیاهان یک گونه را که به بیماری بخصوصی، حساس هستند نابود کند (اشکان، 1385).
علی‌رغم تفاوت‌های موجود از نظر میزان و نوع خسارت‌های مالی ناشی از بیماری‌ها، زارع مطلع و آگاه می‌تواند با استفاده از بهترین رقم موجود، روش‌های مبارزه‌ی زراعی، بیولوژیکی، ژنتیکی و شیمیایی، نه‌تنها مدیریت مناسبی برای محصول خود داشته باشد، بلکه حتی در سال‌هایی که دیگر باغات ضررهای زیادی متحمل شده‌اند، سود بیشتری بدست آورد.
تریستیزای مرکبات[13]، اگزوکورتیس مرکبات[14]، کیسه‌ی صمغی[15]، جاروی جادوگر[16]، گرینینگ[17]، استابورن و شانکر باکتریایی مرکبات[18] از جمله‌ی بیماری‌های مهم مرکبات در ایران و جهان به‌شمار می‌روند (اشکان، 1385).
فهرست پایان نامه جدا سازی و همسانه سازی ژن های hrpW و hrpG جهت انتقال به لیمو ترش در راستای ایجاد مقاومت به شانکر مرکبات
فهرست:
فصل اول: مقدمه و مروری بر منابع
1-مقدمه............................................................................................................................... 2
1-1- مقدمهای بر مرکبات………………………………………………………………………2
1-2- تاریخچه‌ی کشت درختان مرکبات در ایران و جهان…………………………………………4
1-3- سطح زیر کشت، میزان تولید و عملکرد درختان مرکبات در ایران و جهان…………………….4
1-4- اهمیت و انواع بیماری‌های مرکبات………………………………………………………...6
1-4-1- تاریخچه و اهمیت بیماری شانکر مرکبات……………………………………………….7
1-4-2- عامل بیماری…………………………………………………………………………10
1-4-3- علایم و چرخه‌ی بیماری……………………………………………………………...13
1-4-4- ابزارهای ایجاد بیماری تحت اختیار باکتری……………………………………………..14
1-4-5- جذب، اتصال و ورود باکتری به گیاه…………………………………………………...14
1-4-6- سیستم‌های ترشحی باکتری……………………………………………………………15
1-4-7- سیستم ترشحی نوع III (TTSS)………………………………………………………16
1-4-8- ژن‌های hrp و نقش دوگانه‌ی آنها………………………………………………….......17
1-4-9- هارپین‌ها و نقش آنها در القای پاسخ ………………………………………………HR20
1-5- بهره‌گیری از مهندسی ژنتیک در مقاومت به بیماری‌ها………………………………………21
فصل دوم: مواد و روشها
2- محل انجام پژوهش...........................................................................................................25 25
2-1- مواد شیمیایی، آنزیمها و کیتها………………………………………………………….25
2-2- سویههای باکتری………………………………………………………………………..25
2-3- پلاسمیدهای مورد استفاده……………………………………………………………….26
2-4- محیط کشت باکتریها……………………………………………………………….......26
2-5- آنتیبیوتیکها…………………………………………………………………………...27
2-6- طراحی آغازگر………………………………………………………………………….27
2-7- شناسایی و جداسازی باکتری Xcc.................................................................................................29
2-8- خالص سازی DNA ژنومی باکتری Xcc سویهی ………………………..NIGEB.088(A*)31
2-9- تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده……………………………………………….31
2-10- واکنش زنجیرهای پلیمراز با آنزیمهایTaq و Pfu دی.ان.آ پلیمراز جهت جداسازی ژن‌های هدف........................................................................................................................................................31
2-11- الکتروفورز محصولات واکنش زنجیرهای پلیمراز…………………………………............33
2-12- خالصسازی محصول واکنش زنجیرهای پلیمراز………………………………………….33
2-13- جداسازی محصول PCR و یا محصول حاصل از هضم آنزیمی از روی ژل آگارز…………...34
2-14- هضم آنزیمی با آنزیمهای محدود کننده تیپ …………………………………………..II35
2-15- الکتروفورز محصولات واکنشهای هضم آنزیمی…………………………………………39
2-16- واکنش اتصال………………………………………………………………………….39
2-17- تکثیر پلاسمید………………………………………………………………………....42
2-18- اندازهگیری دانسیته نوری(OD) باکتری…………………………………………………..42
2-19- تکنیک Colony-PCR: غربالگری کلونیهای نوترکیب……………………………………42
2-20- استخراج پلاسمید در مقیاس کم ……………………………………(Mini-Preparation)43
2-21- توالییابی……………………………………………………………………………...43
2-22- انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI-hrpW و pBI-hrpG به سویههای آگروباکتریوم تومفاسینس با استفاده از روش ذوب و انجماد………………………………………………………………...43
فصل سوم: نتیجهگیری و بحث
3- شناسایی باکتری Xcc (A*)......................................................................................................................................47
3-1- شناسایی به کمک تست بیماریزایی بر روی گیاه میزبان C.auratifolia.......................................47
3-2- شناسایی به کمک آغازگرهای اختصاصیMS+/MS- و Xac01 / Xac02.....................................48
3-3- استخراج DNA ژنومی از باکتری XCC.......................................................................................49
3-4- تعیین کیفیت و کمیت DNA استخراج شده………………………………………………50
3-5- تکثیر ژن‌هایhrpW و hrpG با واکنش زنجیرهای پلیمراز………………………………….51
3-5-1- طراحی آغازگرهای مناسب…………………………………………………………...51
3-5-2- بهینهسازی شرایط واکنش زنجیرهای پلیمراز……………………………………………51
3-5-3- الکتروفورز محصول واکنش زنجیرهای پلیمراز………………………………………….53
3-6- تایید ناقلهای کلونینگ و بیانی از طریق الگوهای برشی حاصل از هضم توسط آنزیمهای برشی نوع II.......................................................................................................................................................54
3-7- همسانهسازی ژن‌هایhrpG و hrpW در ناقلهای کلونینگ (PGEM7zf(-) , pUC19).............55
3-8- تایید همسانهسازی ژن‌های هدف در ناقلهای کلونینگ (pGEM7zf(-))،( pUC19)..................57
3-8-1- واکنش کلونی PCR کلونهای گزینش شده……………………………………………57
3-8-2- تایید همسانهسازی ژن‌هایhrpW/G در ناقلهای کلونینگ با روش هضم آنزیمی………...58
3-8-3- تایید همسانهسازی ژن‌های hrpW/G در ناقلهای کلونینگ با روش واکنش زنجیرهای پلیمراز......................................................................................................................................................59
3-9- همسانه سازی ژن‌های hrpG/W در ناقل بیانی pBI121...............................................................59
3-10- تایید همسانه سازی ژن‌های hrpG/W در ناقل بیانی pBI121....................................................62
3-10-1- واکنش کلونی PCR کلونهای تشکیل شده…………………………………………...62
3-10-2- تایید همسانهسازی ژن‌های hrpG/W در ناقل بیانی pBI121 با روش واکنش هضم آنزیمی.63
3-10-3- تایید همسانهسازی ژن‌های hrpW/G در ناقل بیانی pBI121 با روش واکنش زنجیرهای پلیمراز……………………………………………………………………………………….64
3-11- توالییابی……………………………………………………………………………..65
3-11-1- نتایج توالییابی……………………………………………………………………..66
3-12- انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpG و pBI.hrpW به سویههای آگروباکتریوم تومفاسینس.67
3-13- تایید انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpW/G به سویههای آگروباکتریوم تومفاسینس……..67
3-13-1- تایید انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI.hrpW/G با روش کلونی PCR................................67
فصل چهارم: جمعبندی کلی و پیشنهادها
4- جمعبندی کلی نتایج……………………………………………………………………….70
4-1- پیشنهادها………………………………………………………………………………71
پیوست
5- دستورالعمل استخراج و خالصسازی DNA ژنومی باکتری xanthomonas citri pv. citri سویه 088(A*) NIGEB-......................................................................................................................................................84
5-1- محلولهای لازم جهت استخراج DNA ژنومی……………………………………………84
5-1-1- مراحل استخراج DNA ژنومی………………………………………………………...85
5-1-2- روش اسپکتروفوتومتری………………………………………………………………86
5-1-3- الکتروفورز بر روی ژل آگارز………………………………………………………….87
6- الکتروفورز با ژل آگارز................................................................................................. 88
6-1- نمای ساده از دستگاه الکتروفورز…………………………………………………………88
6-2- ژل آگارز……………………………………………………………………………….89
6-3- اتیدیوم بروماید………………………………………………………………………....89
6-4- بافر بارگزاری ژل آگارز………………………………………………………………….90
6-5- طرز تهیه محلول …………………………………………………………….TBE 0.5X91
6-6- طرز تهیه آگارز 1%...........................................................................................................91
7- دستورالعمل خالصسازی فرآورده‌های تکثیر شده و قطعات DNA از روی ژل آگارز.....................92
7-1- خالصسازی فرآورده‌های تکثیر شده با کیت ……………………………………..Bioneer92
7-2- خالصسازی قطعات DNA از ژل آگارز.......................................................................................93
8- دستورالعمل تهیه باکتریهای مستعد برای پذیرش DNA خارجی...........................................95
8-1- تهیه سلولهای مستعد E.coli.......................................................................................95
8-2- دستورالعمل تراریزش باکتری مستعد به روش شوک حرارتی......................................................96
8-3- تهیهی سلولهای مستعد و انتقال پلاسمیدهای نوترکیب pBI-hrpW و pBI-hrpG به سویههای آگروباکتریوم تومفاسینس با استفاده از روش ذوب و انجماد................................................................97
9- استخراج پلاسمید در مقیاس کم از باکتری E.coli سویه DH5α.....................................................99
9-1- استخراج پلاسمید به روش دستی………………………………………………………...99
9-2- استخراج پلاسمید با استفاده از کیت MBST (دکتر شایان)………………………................101
9-3- روش تهیه محلول های IPTG و ………………………………………………...X-Gal103
9-3-1- تهیه محلول ایزوپروپیل D-B تیوگالاکتوپیرانوزید (IPTG)....................................................103
9-3-2- تهیه 5 برمو-3 کلرو- اتیدولیل D-B گالاکتوزید (X-Gal)……………………………...103
10- تهیه مایه تلقیح و بهینهسازی شرایط مایهزنی گیاه میزبان..............................................................103
منبع:
ندارد.